組化雙染試劑盒

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

一抗識別抗原，hrp標記二抗識別一抗，hrp催化中間體TY永久性標記抗原且實(shí)現信號放大，紅色色原特異性識別TY產(chǎn)物 （共價(jià)結合），從而實(shí)現了紅色信號的累積，完成了紅色顯色。配合常規免疫組化用DAB，形成棕色物質(zhì)，棕色與紅色，形成特異的組化雙染顏色。

【儲存與運輸】

本試劑需低溫運輸，貯存于-20℃低溫環(huán)境，有效期一年

【使用方法】

hrp 二抗孵育完成后，加入即用型 TY 反應 20min 左右，然后 PBS 洗三次，之后 加入紅色顯色液工作液(PB:CU:紅色色原AC=860:40:1:100)，反應 15 分鐘以上（以上試劑使用前注意解凍為液體狀態(tài)，必要時(shí)混勻離心）。

其他自備試劑：高敏多聚 HRP 組化二抗，一抗，3%過(guò)氧化氫，等。

石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精 5min-75%酒精 5min-蒸餾水洗。

抗原修復：組織切片置于盛滿(mǎn)抗原修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進(jìn)行抗原修復，中火 8min至沸，?；?8min 保溫再轉中低火 7min，此過(guò)程中應防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。

阻斷內源性過(guò)氧化物酶：切片放入 3%過(guò)氧化氫溶液（30%雙氧水：純水=1:9），室溫避光孵育25 min，將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。

BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止抗體流走），在圈內滴加用 3%BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min。

加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加 BSA 按一定比例配好的第一指標一抗，切片平放于濕盒內 4°C 孵育過(guò)夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）

加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗（HRP 標記）覆蓋組織，室溫孵育 50min。

DAB 顯色：將 DAB 色原與 DAB 緩沖液按 1：100 配制成工作液，玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的 DAB 工作液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。

抗原修復：組織切片置于盛滿(mǎn)抗原修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進(jìn)行抗原第二次修復。中火 8min，此過(guò)程中應防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。(修復液和修復條件根據組織來(lái)確定）

BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（加固防止抗體流走），在圈內滴加用 3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉 30min。

加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的第二指標一抗，切片平放于避光濕盒內 4°C 孵育過(guò)夜。（濕盒內加少量水防止抗體蒸發(fā)）

加二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗（HRP 標記）覆蓋組織，室溫孵育 50min。

紅色顯色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌 3 次，每次 5min。切片稍甩干后在圈內滴加預解凍的 TY 反應液反應 20min，然后 PBS 洗三次，之后 加入紅色顯色液工作液(PB:CU:紅色色原：AC=860:40:1:100)反應 15min，顯微鏡下可控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為紅色，自來(lái)水沖洗切片終止顯色。

復染細胞核：Harris 蘇木素復染 3min 左右，自來(lái)水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來(lái)水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。

脫水封片：將切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min –無(wú)水乙醇Ⅰ6min -無(wú)水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來(lái)稍晾干，中性樹(shù)膠封片。

顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

石蠟切片免疫組化結果判讀：蘇木素染細胞核為藍色，第一指標 DAB 顯出的陽(yáng)性表達為棕黃色，第二指標紅色顯色的陽(yáng)性表達為紅色或粉紅色。

【注意事項】

1. DAB 顯色盡量不要過(guò)深，過(guò)深會(huì )影響紅色顯色效果

2.雙染的兩個(gè)抗原 盡量表達位置不同（如標記不同細胞 或者 不同表達位置），不適用于兩個(gè)抗原的共定位（不同于熒光的共定位）

3 紅色顯色抗原所對應的一抗抗體濃度適當提高一些，組化二抗應使用高敏多聚二抗。