一、實(shí)驗原理

　　活性氧簇ROS是由氧分子還原所形成的分子或者離子，大部分都是由線(xiàn)粒體產(chǎn)生的副產(chǎn)物，它們會(huì )在細胞代謝包括細胞內呼吸和底物氧化過(guò)程中產(chǎn)生。適量的ROS是細胞必需的，因為ROS參與維持細胞存活及生理功能所需的各種生活過(guò)程，如信號轉導和基因表達，但過(guò)量或過(guò)少的ROS都會(huì )誘導氧化應激，破壞核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和細胞膜等，導致細胞死亡和組織破壞。

　　DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細胞膜，進(jìn)入細胞后，被水解生成DCFH。而DCFH不能透過(guò)細胞膜。細胞內的ROS可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF被488nm激發(fā)光激發(fā)后，發(fā)射530nm的熒光信號，被FITC通道接收，檢測DCF的熒光就可以判定細胞內活性氧ROS的水平。

　　二、實(shí)驗步驟

　　1、收集細胞：細胞懸液轉入離心管中，1500 rpm離心5 min收集細胞,棄上清。

　　2、PBS洗滌細胞：加入3ml 4℃預冷的PBS完全重懸細胞，1500 rpm離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻。

　　3、細胞計數：移取10 ul在血細胞計數儀上進(jìn)行細胞計數,調整細胞為1×10^6-2×10^8/ml。

　　4、裝載探針：按照1:1000用無(wú)血清培養基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10umol/L。

　　5、孵育探針：37℃細胞培養箱內孵育20 min，每隔3-5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸，用無(wú)血清的培養液洗滌細胞三次，以去除未進(jìn)入細胞內的探針。

　　6、上機檢測：流式細胞儀使用激發(fā)波長(cháng)488nm，發(fā)射波長(cháng)525±20nm進(jìn)行檢測，用FlowJo軟件分析細胞ROS水平。

　　三、結果分析

　　結果說(shuō)明：平均熒光強度值越大，表明細胞內ROS含量越高。