普通生化檢測（組織）

一、上機生化實(shí)驗目的及原理

　　1.肝功能八項：肝功能檢查的目的在于探測肝臟有無(wú)疾病、肝臟損害程度以及查明肝病原因、判斷預后和鑒別發(fā)生黃疸的病因等

　　谷丙轉氨酶(ALT/GPT)：

L-丙氨酸+α-酮戊二酸 ^ALT > 丙酮酸+L-谷氨酸

丙酮酸+NADH+H^+ LDH > 乳酸+NAD⁺

在340nm波長(cháng)測定NADH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　谷草轉氨酶(AST/GOT)：

L-天冬門(mén)氨酸+α-酮戊二酸 ^AST > 草酰乙酸+谷氨酸

草酰乙酸+NADH ^MDH > 乳酸+NAD⁺

在340nm波長(cháng)測定NADH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　γ-谷氨?；D移酶(GGT)：

γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺+雙甘氨肽 ^r-G > γ-谷氨酰雙甘氨肽+5-氨基-2-硝基甲苯酸，在405nm波長(cháng)測定每分鐘吸光度的變化率△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　總膽紅素(T-BIL)：

在PH3左右有表面活性劑和加速劑的條件下，樣品中的總膽紅素被氧化劑釩酸鈉氧化為膽綠素。膽紅素的黃色特異性吸光度下降，通過(guò)測定釩酸鹽氧化前后吸光度的變化，計算出樣品中總膽紅素的含量。(兩點(diǎn)終點(diǎn)法)

　　直接膽紅素(D-BIL)：

在PH3左右有表面活性劑和加速劑的條件下，樣品中的直接膽紅素被氧化劑釩酸鈉氧化為膽綠素。膽紅素的黃色特異性吸光度下降，通過(guò)測定釩酸鹽氧化前后吸光度的變化，計算出樣品中直接膽紅素的含量。(兩點(diǎn)終點(diǎn)法)

　　堿性磷酸酶(ALP)：

血清中的堿性磷酸酶在堿性條件下作用于對硝基苯磷酸鈉，生成對-硝基酚和磷酸鹽，在405nm波長(cháng)測定每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(速率法)

　　白蛋白(ALB)：

在PH4.20左右的條件下，白蛋白分子上的正電荷魚(yú)溴甲酚綠上的陰離子集團結合形成綠色的復合物，在630nm波長(cháng)測定吸光度，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　總膽汁酸(TBA)：

膽汁酸+S-NAD ^3α-HSD > 3-酮類(lèi)固醇+S-NADH

3-酮類(lèi)固醇+S-NAGH ^3α-HSD > 膽汁酸+NAD，

不斷完成循環(huán)反應，在405nm波長(cháng)測定每分鐘S-NADH吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性(兩點(diǎn)速率法)

　　2.腎功能三項：反映腎分泌寄代謝功能

　　尿素/尿素氮(UREA/BUN)：

尿素+H₂O+2H^+ 尿素酶 > 2NH₄⁺ +CO₂

2NH₄+ + α-酮戊二酸+NADH^+ GLDH > 谷氨酸+NAD⁺ +H₂O

在340nm波長(cháng)測定NADH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其含量(兩點(diǎn)速率法)

　　尿酸(UA)：

尿酸+H₂O+O₂ ^UAO > 尿囊素 +CO₂+H₂O₂

H₂O₂ + 4-AAP+DHBS ^POD > 醌亞胺 +H₂O

在510nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量(終點(diǎn)法)

　　肌酐(CREA)：

肌酐+H₂O ^肌酐酶 > 肌酸　　肌酸+H₂O ^肌酐酶 > 肌氨酸+脲

肌氨酸 + H₂O +O₂ ^{肌氨酸氧化酶} > 甘氨酸+HCHO + H₂O₂

2H₂O₂ + 4-AAP+TOOS ^{過(guò)氧化物酶} > 紅色醌型化合物 +4H₂O

在546nm波長(cháng)測定紅色醌型化合物的吸光度值，計算其含量。(兩點(diǎn)終點(diǎn)法)

　　3.血脂四項：

反映血液脂質(zhì)含量

　　總膽固醇(TC)：

血清中的脂化膽固醇經(jīng)膽固醇脂酶水解產(chǎn)生游離膽固醇，與原有的游離膽固醇一同被膽固醇氧化酶氧化生成膽甾烯酮和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫酶使過(guò)氧化氫分解出氧的游離基，它同4-氨基安替比林和酚生成紅色醌型化合物，在510nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　甘油三酯(TG)：

甘油三酯+H₂O ^脂肪酶 > 甘油+脂肪酸

甘油 + ATP ^甘油激酶 > 甘油-3-磷酸+ADP

甘油-3-磷酸+O₂ ^{3-磷酸甘油氧化酶} > H₂O₂+磷酸羥基丙酮

H₂O₂ +4-氨基安替比林+對氯酚 ^{過(guò)氧化物酶} > 紅色醌型化合物

在510nm波長(cháng)下測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)：

通過(guò)加入低密度脂蛋白膽固醇的抑制劑，將低密度和極低密度部分隱藏起來(lái)，直接測定高密度部分的膽固醇含量。顯色反應原理同總膽固醇，在510nm波長(cháng)測定吸光值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)：

低密度脂蛋白包括極低密度脂蛋白，能與磷鎢酸鎂和聚乙二醇復合劑作用產(chǎn)生沉淀，用分散劑可使沉淀顆粒細小均一，在620或630nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　4.血糖：

反映血液糖類(lèi)含量

　　葡萄糖(Glu)：

血清中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下，生成過(guò)氧化氫，用過(guò)氧化物酶將過(guò)氧化氫分解出氧的游離基，它將4-氨基安替比林和酚氧化為紅色的醌型化合物，在510nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　糖化血清蛋白/果糖胺(GSP)：

GSP上的酮胺結構使氯化硝基氮唑藍(NBT)還原成紫色的甲臜，在546nm波長(cháng)測定標準和樣品的吸光度變化率(△A/分鐘)，計算其含量。(兩點(diǎn)速率法)

　　5.心肌酶譜：

反映心肌損傷

　　肌酸激酶(CK)：

磷酸激酶+ADP ^CK > 肌酸+ATP+H⁺

葡萄糖 + ATP ^HK > 葡萄糖-6-磷酸+ADP+H⁺

葡萄糖-6-磷酸+NADP^+ G6PDH > 6-磷酸-葡萄糖酸+NADPH+H⁺

在340nm波長(cháng)測定NADPH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　肌酸激酶同工酶(CKMB)：

用特異抗CK-M抗體將CK-M抑制，測定CK-B的活性，其中包含50%CK-MB的活性，將測定結果乘以2即為CK-MB的活性。

磷酸肌酸+ADP ^CK-B > 肌酸+ATP+H⁺

葡萄糖 + ATP ^HK > 葡萄糖-6-磷酸+ADP+H⁺

葡萄糖-6-磷酸+NADP^+ G6PDH > 6-磷酸-葡萄糖酸+NADPH+H⁺

在340nm波長(cháng)測定NADPH每分鐘吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　乳酸脫氫酶(LDH-L)：

L-乳酸+NAD^+ LDH-L > 丙酮酸+NADH

在340nm波長(cháng)測定每分鐘NADH吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　乳酸脫氫酶同工酶(LDH-1)：

L-乳酸+NAD^+ LDH1 > 丙酮酸+NADH+H⁺

在硫氰酸胍抑制劑存在的條件下抑制了LDH2-5，在340nm波長(cháng)測定每分鐘NADH吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　6.無(wú)機離子：

維持體內的電解質(zhì)、酸堿平衡和滲透壓平衡。

　　鈣(Ca)：

在堿性條件下，鈣離子與鄰甲酚酞絡(luò )合酮(OCPC)形成紫紅色復合物，用8-羥基喹啉消除鎂離子的干擾，在578nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　氯(Cl)：

2Cl^– +Hg(SCN)₂       > HgCl₂+2SCN^–

2SCN^– + Fe³⁺        > Fe(SCN)₃

在510nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　無(wú)機磷(IP)：在酸性條件下，樣本中的無(wú)機磷與鉬酸銨反應生成非還原性磷鉬酸化合物，

　　在340nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　鎂(Mg)：在堿性條件下，鎂離子與染料Calmagite結合，生成紫紅色復合物，在546nm

　　波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　鐵(Fe)：血清中的三價(jià)鐵被還原劑還原為二價(jià)鐵，二價(jià)鐵同菲啰嗪形成紫色的化合物，在578nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　鋅(Zn)：血清中的鋅離子與鋅試劑形成藍色化合物，由于顯色劑本身為紅色，在低含量水平范圍呈紫色，除干擾劑將樣本中的銅離子、鐵離子隱蔽起來(lái)，在630nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　鈉(Na)：鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷在鈉依賴(lài)性β-D-半乳糖苷酶催化下生成鄰-硝基酚和半乳糖，鄰-硝基酚的生成量和樣品中鈉離子的濃度呈正比。鄰-硝基酚在堿性環(huán)境中呈黃色，可在405nm波長(cháng)處檢測吸光度的升高速度，計算鈉離子的濃度。(兩點(diǎn)速率法)

　　鉀(K)：血清中的鉀離子在蛋白水解酶的作用下，從蛋白分子的吸附下解脫出來(lái)與四苯硼鋰呈濁度反應，在620nm或630nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　7.總蛋白(TP)：

樣本中蛋白質(zhì)分子的肽鍵與雙縮脲試劑中的銅結合形成紫色化合物，在546nm波長(cháng)測定吸光度值，計算其含量。(終點(diǎn)法)

　　8.α淀粉酶(AMS)：

Gal-G₂-CNP ^a-AMY > Gal-G₂+CNP

在405nm波長(cháng)測定每分鐘CNP吸光度的變化率(△A/分鐘)，計算其活性。(速率法)

　　二、尿常規相關(guān)

　　A、尿常規檢測項目及意義

　　1、檢測項目：

對尿液中的白細胞(WBC)、酮體(KET)、亞硝酸鹽(NIT)、尿膽原(URO)、膽紅素(BIL)、蛋白質(zhì)(PRO)、葡萄糖(GLU)、尿比重(SG)、酸堿度(PH)、隱血(BLD)、肌酐(CR)、尿鈣(Ca)、微白蛋白(MA)十三項化學(xué)指標進(jìn)行半定量或定性檢測，為診斷和科研提供參考，適用于篩選試驗或輔助診斷。

　　2、采用干化學(xué)法，配套尿液分析儀對尿液中各項待測成分進(jìn)行檢測，尿液中的各項待測成分可使尿試紙條上相應的試劑塊發(fā)生顏色變化，反應顏色的深淺與尿液中相應待測成分濃度成一定比例關(guān)系。通過(guò)此方法對泌尿系統疾病、肝膽疾病、糖尿病等疾病進(jìn)行輔助診斷與療效觀(guān)察，尿干化學(xué)檢測僅作為篩選試驗，并且不能以此作為單一的診斷方法。

　　B、檢測原理

　　1、空白塊(校正塊)：

尿在測試塊上分布的狀態(tài)及尿本身的顏色一般都會(huì )給測定結果帶來(lái)誤差，設空白塊就是為了排除這些產(chǎn)生誤差的因素，各項目都使用同一空白塊。

　　2、白細胞：

根據酯酶法的原理，粒細胞漿內還有酯酶，這種酶能水解一種3-羥基吲哚酚酯類(lèi)底物，釋放出酚從而與重氮試劑反應生成紫紅色化合物。

　　3、酮體：

根據硝普酸鈉法原理，硝普酸鈉和酮體(乙酰乙酸)在堿性條件下相互作用而呈現紫色，特別是乙酰乙酸對此特別靈敏。

　　4、亞硝酸鹽：

反應依賴(lài)于尿中革蘭氏陰性細菌把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與對氨基苯砷酸反應生成重氮化合物，重氮化合物再與萘基乙二胺二鹽酸結合呈現出桃紅色。

　　5、尿膽原：

根據偶氮結合法的原理，尿膽原在強酸條件下和重氮鹽偶聯(lián)形成胭脂紅色素。

　　6、膽紅素：

根據偶氮偶合法的原理，2，4-二氯苯胺重氮鹽與膽紅素進(jìn)行特異性反應，并與膽紅素的濃度相應產(chǎn)生不同的顏色。

　　7、蛋白質(zhì)：

根據染料結合的蛋白誤差法原理，蛋白質(zhì)與染料結合形成復合物產(chǎn)生色變，特別是對白蛋白的反應比對球蛋白、血紅蛋白、本-周氏蛋白和粘蛋白更為靈敏。

　　8、葡萄糖：

根據葡萄糖氧化酶法反應原理，葡萄糖氧化酶特異性氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖醛酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶的作用下，使指示劑氧化而呈現出紫紅色。

　　9、尿比重：

利用多聚電解質(zhì)方法，尿中電解質(zhì)與聚電解質(zhì)發(fā)生離子交換的原理。陽(yáng)離子存在時(shí)，多聚物氫離子通過(guò)交換釋出，使溴百里酚藍指示劑發(fā)生顏色變化，顏色由藍經(jīng)過(guò)藍綠最后變成黃色。

　　10、酸堿度：

通過(guò)PH指示劑測定5.0-9.0的范圍內的PH值。

　　11、隱血：

根據血紅蛋白接觸活性法原理，通過(guò)血紅蛋白的類(lèi)過(guò)氧化物酶樣作用催化分解過(guò)氧化物，使四甲基聯(lián)苯胺氧化呈色。

　　12、肌酐：

根據肌酐與3,5-二硝基苯甲酸反應產(chǎn)生紫紅色，顏色深淺與肌酐的濃度成正比關(guān)系。

　　13、尿鈣：

根據鈣離子與鄰甲酚酞絡(luò )合酮反應產(chǎn)生紫紅色，顏色深淺與鈣離子的濃度成正比關(guān)系。

　　14、微白蛋白(微量白蛋白)：

根據染料結合的蛋白誤差法原理，微量白蛋白與染料結合形成復合物產(chǎn)生色變，對白蛋白的反應靈敏。

　　C、樣本的采集與保存

　　1、留取尿液標本一般應盡量采用新鮮晨尿，因為夜間飲水較少，腎臟排到尿液中的多種成分都儲存在膀胱內并進(jìn)行濃度，易于查到，提高陽(yáng)性檢出率，其他隨機留取的尿液也可，但應以留取中段尿為好。

　　2、按排尿的先后測序，可將尿液分為前段、中段、后段。因前段尿和后段尿容易被污染，因此，一般都留取中段尿。

　　3、女性留取尿標本時(shí)應避開(kāi)經(jīng)期，以防止陰道分泌物混入尿液中，影響檢查結果。

　　D、實(shí)驗要求

　　1、樣本要求：

不要在尿樣中加入防腐劑。尿樣不可離心，測試前將尿樣混勻。注射或服用維生素C會(huì )使亞硝酸鹽、膽紅素、葡萄糖、隱血檢測結果偏低甚至出現假陰性，應用藥10小時(shí)后再進(jìn)行測定。

　　2、環(huán)境要求：

環(huán)境溫度(25±5)℃，相對濕度≤80%，推薦最佳測試溫度23-27℃。

　　三、凝血相關(guān)

　　1、抽取靜脈血，自己配置3.8%(或3.2%)的枸櫞酸鈉抗凝劑：需要按照9份靜脈血、1份抗凝劑的比例取樣，輕輕顛倒10次使之充分混勻，不得有凝塊，不得形成泡沫，離心后提取上清，然后干冰運輸。成品抗凝劑管按抗凝管規格加入全血量，使其抗凝劑與血液的比例為1：9，舉例：真空采血管中含有3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑約0.2mL，采血至2.0mL。

采樣后應盡快分離血漿(60分鐘內進(jìn)行)，將標本以3000r/min離心10-15分鐘，使血漿分層，取上層血漿。

　　2、血漿室溫放置，宜在2小時(shí)內檢測。血漿若不能及時(shí)檢測，分離后的血漿-20℃以下密封可保存2周，干冰運輸。測定前37℃快速融化，輕微混勻后立即檢測。

　　3、對凝固、有凝塊、嚴重溶血、重度黃疸、脂血、采血量不符合要求或無(wú)標識等不合格的標本，距采集時(shí)間超過(guò)2小時(shí)并且沒(méi)有按要求儲存的樣本，應按照不合格標本處理