一、項目介紹

EMSA 是一種用于研究核酸和蛋白質(zhì)之間相互作用的技 術(shù)，適用于轉錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗證性實(shí)驗，主要是 驗證蛋白質(zhì)與特定核酸序列的結合特性，從而間接推斷已知蛋 白質(zhì)的靶序列或已知序列的結合蛋白質(zhì)分子。

二、實(shí)驗步驟

1、 蛋白的提取

漿蛋白核蛋白提?。毎说鞍着c細胞漿蛋白抽提試劑盒）

1.1 準備溶液：室溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A備用，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。取適當量的細胞核蛋白抽提試劑備用，在使用前數分鐘內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

1.2 對于貼壁細胞：用PBS洗一遍，用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.3 對于懸浮細胞：用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。

1.4 對于新鮮組織：

1 

1.1 

1.2 

1.3 

1.4 

1.4.1 把組織盡可能切成非常細小的碎片。按照20:1的比例混合適當量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如200微升細胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B)。并加入PMSF至最終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。

1.4.2 勻漿后把勻漿液轉移到塑料離心管內，冰浴放置15分鐘。

1.4.3  4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉移至一預冷的塑料管中，為抽提得到的部分細胞漿蛋白。(吸上清時(shí)千萬(wàn)不要觸及沉淀。)

1.4.4 對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細胞還沒(méi)有破碎。

1.4.5 

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1.4.40 

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1.4.42 

1.4.5 每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬(wàn)Hela細胞，其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)

1 

1.1 

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1.3.1 

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1.3.3 

1.3.4 

1 

1.3 

1.3.4 

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1.4.1 

1.4.2 

1.4.3 

1.4.4 

1.4.6 最高速劇烈Vortex 5秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。(如果細胞沉淀沒(méi)有完全懸浮并分散開(kāi)，可以適當延長(cháng)vortex時(shí)間。)

1.4.7 冰浴10-15分鐘。

1.4.8 加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。

1.4.9 最高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。

1.4.10 立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以?xún)龃妗?千萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)

1.4.11  對于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì )帶來(lái)細胞漿蛋白的污染。)

1.4.12  最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。

1.4.13  4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。

1.5  每20微升細胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細胞漿蛋白抽提試劑A。(對于二百萬(wàn)Hela細胞，其細胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。)

1.6  最高速劇烈Vortex 5秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。(如果細胞沉淀沒(méi)有完全懸浮并分散開(kāi)，可以適當延長(cháng)vortex時(shí)間。)

1.7  冰浴10-15分鐘。

1.8  加入細胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。最高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。

1.9  最高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。

1.10  立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以?xún)龃妗?千萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。)

1.11  對于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑。(不吸盡上清會(huì )帶來(lái)細胞漿蛋白的污染。)

1.12  最高速劇烈Vortex 15-30秒，把細胞沉淀完全懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。

1.13  4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。

1.14  立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞核蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以-70℃凍存。

2、 制膠  （1.5mm膠，大約30分鐘膠會(huì )凝）

待膠完全凝固后120v預電泳1h，緩沖液用預冷的0.5×TBE。

3、 蛋白與探針?lè )磻?注：蛋白濃度1 ug/uL ,上樣體積2 uL)

混合后室溫放置20分鐘。

4、 上樣

預電泳完后馬上更換預冷的電泳緩沖液，加5ul的5×上樣緩沖液到樣品混合液中，馬上上樣電泳。180v ，60min。

5、 電轉移

將帶正電的尼龍膜放入0.5×TBE中平衡10分鐘。待電泳完成后將加有樣品的整塊膠取下電轉。轉膜緩沖液為預冷的0.5×TBE。300m A 30分鐘。

6、 交聯(lián)

轉膜完成后將膜取出，放在一張干凈的濾紙上，做好標記。于紫外燈下20cm處作用20分鐘。

7、 封閉

將交聯(lián)完成的尼龍膜取出放入洗凈的孵育槽，用封閉液封閉20分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖)。

8、 抗體反應

   倒掉封閉液。用封閉液將抗體稀釋300倍后，與膜完全作用30分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。(慢搖).

9、 洗脫

        用1×的洗脫液清洗3次,每次5分鐘。搖床速度加大。

10、平衡

用平衡液平衡5分鐘。

11、ECL發(fā)光檢測

12、圖像分析（灰度比分析結果見(jiàn)EXCEl表格）