項目介紹：

　　1.原位雜交原理：原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進(jìn)行。

　　2.所需器材：

　　脫水機G-JT12s，包埋機G-L5/p5,病理切片機RM2016，凍臺G-P1，烤箱GFL-70/230,組織攤片機G-KDP，載玻片及蓋玻片，正置熒光顯微鏡，成像系統，恒溫箱，高壓滅菌鍋，移液槍?zhuān)姅[搖床。

　　3.主要試劑：DEPC。原位雜交固定液。PBS緩沖液。20×SSC洗脫液。蛋白酶K。DAPI?？篃晒獯銣绶馄瑒?。雜交液。

　　石蠟切片熒光探針原位雜交實(shí)驗步驟

　　1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

　　2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

　　3、切片：石蠟經(jīng)切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

　　4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　5、消化：根據組織固定時(shí)間長(cháng)短，切片于修復液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫(huà)圈，根據不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

　　6、預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。

　　7、雜交：傾去預雜交液，滴加含探針雜交液, 濃度，恒溫箱度雜交過(guò)夜。

　　8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　9、DAPI復染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

　　10.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長(cháng)330-380nm，發(fā)射波長(cháng)420nm,發(fā)藍光;FAM(488)綠光激發(fā)波長(cháng)465-495nm，發(fā)射波長(cháng)515-555 nm，發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長(cháng)510-560，發(fā)射波長(cháng)590nm，發(fā)紅光。)DAPI染核，為藍光。

　　注意事項：

　　1.1.mRNA為檢測對象時(shí)，需嚴格要求實(shí)驗環(huán)境經(jīng)無(wú)RNA酶處理。

　　2.FISH切片保存時(shí)間較短，應盡快取圖。