一、實(shí)驗簡(jiǎn)介

　　細胞轉染是指將外源分子如DNA、RNA等導入真核細胞的技術(shù)。主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉染法、病毒介導的轉染等，理想的轉染方法是具有高轉染效率、對細胞毒性作用小等。其中脂質(zhì)體轉染是常用的簡(jiǎn)便轉染方法。

　　脂質(zhì)體(liposome)轉染方法的原理在于，陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用將DNA分子包裹，形成DNA-脂復合體，被表面帶負電荷的細胞膜吸附。再通過(guò)膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾通過(guò)直接滲透作用，將DNA轉運至細胞內，形成包涵體或進(jìn)入溶酶體。當DNA從包涵體內釋放后，進(jìn)入細胞質(zhì)，再進(jìn)一步進(jìn)入核內實(shí)現轉錄、表達。

　　二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA轉染細胞實(shí)驗步驟(以6孔板為例)

　　1 轉染前一天接種細胞于6孔板，5×104每孔，第二天轉染時(shí)細胞匯合度達到60%-70%每孔。

　　2 轉染前半小時(shí)將完全培養基換無(wú)血清培養基1.9 ml。

　　3 A液：RNA100pmol/DNA 2μg(根據核酸類(lèi)型不同，用量不同)加入50 ul Opti-MEM無(wú)血清培養基，輕輕混勻，室溫靜置5min。

　　4 B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體5ul 加入50 ul Opti-MEM無(wú)血清培養基，輕輕混勻，室溫靜置5min。

　　5 B液加入到A液中，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

　　6 將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加邊前后左右十字交叉輕輕搖晃。

　　7 孵箱37℃培養4~6h，然后將無(wú)血清培養基換成完全培養基繼續培養。

　　8 mRNA 水平的檢測：在轉染后24-48h后，用Real-time PCR的方法在mRNA水平進(jìn)行檢測。

　　9 蛋白水平的檢測：在轉染后48-72h后，用Western-blot或免疫組化的方法在蛋白水平進(jìn)行檢測。