鬼筆環(huán)肽（紅光）

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱(chēng)鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏菌(Amanitaphalloides)中分離到的一種雙環(huán)肽，可以極高的親和力和特異性與肌動(dòng)蛋白絲 F-actin 結合，不會(huì )結合單體肌動(dòng)蛋白（G-actin）。鬼筆環(huán)肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動(dòng)植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計量比結合。不像肌動(dòng)蛋白抗體，對不同物種或來(lái)源的機動(dòng)蛋白親和力會(huì )發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結合幾乎可以忽略，染色和未染色區域的差異非常明顯。鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對 F-actin 染色，可以非常方便的標記、識別和定量研究 F-actin 的分布。

本產(chǎn)品為熒光染料 TRITC 標記的鬼筆環(huán)肽，以 20 μM 儲存液形式提供，溶劑為甲醇。常用濃度范圍 80-200nM，每次染色使用 200 μL 工作液即可。

【儲存與運輸】

冰袋（wet ice）運輸，-20℃避光保存；有效期 12 個(gè)月。

【使用方法】

試劑準備：自備 1×PBS 緩沖液（pH 7.2-7.4），固定液（貨號：HK2003），細胞通透劑（貨號：HKI0048），抗熒光淬滅封片劑（貨號：HKI0007），即用型 DAPI 染色液（貨號：HKI0005）等。

工作液配制：用 1×PBS 將本產(chǎn)品稀釋到需要的工作濃度，常用工作濃度為 80-200 nM。推薦使用 100nM，即每 1 μL TRITC 標記鬼筆環(huán)肽與 199 μL PBS 混勻。最佳染色工作濃度請參考文獻或進(jìn)行預實(shí)驗摸索。鬼筆環(huán)肽染色工作液，現配現用，室溫避光保存。

操作步驟

1. 培養好的細胞爬片（密度至少達到半匯合），去除培養液，用 37℃預熱的 1×PBS 緩

沖液清洗細胞清洗細胞 2 次。

2. 加入含 4%甲醛的固定液覆蓋細胞，室溫固定 10 min。注意，甲醇能破壞肌動(dòng)蛋白，因此固定液中不得含有甲醇，避免使用含甲醇的甲醛溶液。

3. 用 1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

4. 用細胞通透劑覆蓋細胞，室溫透化細胞 5-10 min。

5. 用 1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

6. 細胞爬片稍微甩干后，用組化筆畫(huà)圈使細胞位于圈中央。取 200 μL 現配的 TRITC 標記鬼筆環(huán)肽染色工作液完全覆蓋細胞，室溫避光孵育 30 min。注意，通常情況下，4-37℃均適合染色。為避免染色工作液揮發(fā)導致干片，孵育過(guò)程需將細胞爬片置于密封容器內，例如避光濕盒。

7. 用 1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min。

8. （可選做）向爬片上滴加即用型 DAPI 染色液覆蓋細胞，進(jìn)行細胞核染色 3-5 min。用1×PBS 緩沖液清洗細胞 2-3 次，每次 30 s-1 min

9. 細胞爬片稍甩干后，倒置在滴加一滴抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，用紙巾吸掉對于封片劑。

【可選步驟】：完成步驟 7 后，直接將蓋玻片倒置在滴加含 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑（貨號：HKI0007-2）的載玻片上，然后吸掉多余的封片劑。以熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結果。

10. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察結果，選擇 TRITC（Ex/Em=546/575 nm）和 DAPI（Ex/Em=364/454nm）通道。

【注意事項】

1. 熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快完成檢測及觀(guān)察拍照。

2. 甲醇可以破壞 actin 蛋白，因此樣本前期固定不能使用含有甲醇的固定液。

3. 鬼筆環(huán)肽通常不具有細胞通透性，極少用于活細胞染色。

4. 本產(chǎn)品溶劑為甲醇，極易揮發(fā)，每次用完以后需及時(shí)擰緊管蓋密封保存。

5. 操作時(shí)請穿實(shí)驗服，并佩戴一次性手套。