按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，不同指標操作不一樣。具體以訂購的試劑盒說(shuō)明書(shū)為準?；静襟E如下：

　　1.包被：用碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10μg/ml。在聚苯乙烯酶標板的每孔加100μl，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。(一般商品化的試劑盒中已包被好抗體，此步驟可省略)

　　2.封閉：每孔加入200ul封閉液，37℃或室溫孵育1-2 h。

　　3.洗滌：小心揭掉封板膜，放入洗板機，洗滌3-5遍。也可以手動(dòng)洗板：棄去液體，每孔加入300ul洗液，浸泡1-2min，在吸水紙上拍干，重復3-5遍。(一般商品化的試劑盒中已包被好抗體，前三個(gè)步驟可省略)

　　4.加樣：加適當稀釋的待檢樣品100μl于上述已包被的反應孔中。(同時(shí)做空白孔，倍比稀釋的標準品孔，有條件可加做陰性對照孔及陽(yáng)性對照孔作為質(zhì)控點(diǎn))。

　　5.溫育：用封板膜封板后置37℃孵育1-2 h。

　　6.洗滌：同步驟3。

　　7.加抗體：于各孔中加稀釋好的生物素化抗體工作液100 μl。

　　8.溫育：用封板膜封板后置37℃孵育1 h。

　　9.洗滌：同步驟3。

　　10.加酶結合物：于各孔中加稀釋好的酶結合物工作液100 μl。

　　11.溫育：用封板膜封板后置37℃避光孵育30 min。

　　12.洗滌：同步驟3。

　　13.加顯色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反應10～30min，直到倍比稀釋的標準品孔出現明顯的顏色梯度為止。

　　14.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸100 μl，顏色由藍色變?yōu)辄S色。

　　15.結果測定：10min內，在酶標儀上，于450nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值。

　　二、ELISA結果計算

　　根據標準品的濃度和OD值做標準曲線(xiàn)，然后根據標準曲線(xiàn)方程計算出樣本濃度。

　　三、注意事項

　　1、樣本要求：樣本應清澈透明，懸浮物應離心去除;避免使用溶血、高血脂樣本。樣本收集后若不立即檢測，凍存于-80°冰箱，避免反復凍融。樣本每次檢測使用前要混勻，用完后將相應版布局及樣本編號記錄在實(shí)驗本上，樣本及時(shí)放入冰箱。

　　2、實(shí)驗前準備

　　1.對應訂單找到相應的樣本和試劑盒。

　　2.核對樣本個(gè)數、種類(lèi)、編號、樣本量是否足夠，核對試劑盒種屬、個(gè)數、日期，確定試劑盒是否夠用、有沒(méi)有過(guò)期。

　　3.注意訂單上備注欄客戶(hù)的要求，是否做復孔等。(以上三點(diǎn)有問(wèn)題在實(shí)驗前及時(shí)與銷(xiāo)售溝通)

　　注：安排好時(shí)間，注意實(shí)驗節奏，做好相應的記錄幫助記憶，安排要有條理。

　　3、操作要求

　　1.試劑盒在使用前要平衡到室溫，底物在使用前應保存在暗處，避光;

　　2.正式實(shí)驗前需做預實(shí)驗確定合適的稀釋倍數，做預實(shí)驗前注意說(shuō)明書(shū)上建議稀釋倍數。預實(shí)驗雙抗夾心法選取標曲最高兩個(gè)點(diǎn)，競爭法選取標曲最高點(diǎn)與最低點(diǎn)，選取兩個(gè)樣本根據建議稀釋倍數稀釋三個(gè)梯度;

　　3.孵育溫度與時(shí)間準確;洗板非常重要，每步洗板都一定要洗干凈;

　　4.標準品在用前稀釋?zhuān)蚁♂尩拿恳徊蕉家靹?，注意標曲的起始濃度是否與重溶濃度一致;

　　5.點(diǎn)樣量一定要精確，完全打盡移液槍內樣本與試劑，快速、等量的將試劑分配到各個(gè)微孔中;

　　6.抗體和HRP稀釋倍數要嚴格按照說(shuō)明書(shū)規定稀釋;

　　7.各步驟之間，需用封板貼密封反應板避免蒸發(fā);實(shí)驗一旦開(kāi)始，應連續完成所有的實(shí)驗步驟，切勿中斷。

　　4、常用各個(gè)廠(chǎng)家試劑盒操作不同及需注意的地方

　　欣博盛：抗體和HRP都是30倍稀釋?zhuān)覍?shí)驗中每步都要洗板5次

　　eBiosience(備貨需包板)：包被液用前需稀釋10倍，稀釋液用之前要稀釋5倍，包被抗體檢測抗體以及HRP都是250倍稀釋。用前要提前算好所需試劑量，包被4度過(guò)夜，反應溫度為室溫。

　　聯(lián)科/eBiosience(商品已包被)：標準品稀釋液與樣本稀釋液不是通用稀釋液;檢測緩沖液用之前要稀釋;加樣前需要洗板，在板干之前加樣且標準品樣本和抗體連續加入，操作不要中斷，反應溫度為室溫搖床。

　　優(yōu)爾生/華美：加樣孵育后加抗體之前不需要洗板，加完抗體孵育后加HRP之前洗板3次，加完HRP孵育后顯色前洗板5次。華美試劑盒標準品稀釋液與樣本稀釋液為通用稀釋液，優(yōu)爾生沒(méi)有樣本稀釋液，一般用PBS稀釋。

　　注：以上均為常見(jiàn)的試劑盒廠(chǎng)家，進(jìn)口試劑盒及競爭法試劑盒仔細核對說(shuō)明書(shū)后操作。