IF+TUNEL雙染

【產(chǎn)品信息】

石蠟切片熒光tunel+免疫熒光雙標實(shí)驗步驟
1、?石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ12min-二甲苯Ⅱ12min-無(wú)水乙醇Ⅰ6min-95%酒精6min-85%酒精6min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時(shí)間稍微延長(cháng)）。
2、?修復：組織切片置于盛滿(mǎn)EDTA修復液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進(jìn)行抗原修復，中火8min?；?min
中低火7min，此過(guò)程中應防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3、?阻斷內源性過(guò)氧化物酶：切片加上3%的雙氧水，室溫孵育25min，將玻片置PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4、?血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止抗體流走），在組化圈內滴加3%BSA?均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
5、?加一抗：切片稍甩干后用在圈內滴加按一定比例稀的抗體覆蓋組織。切片平放于濕盒內4°C孵育過(guò)夜。
6、?加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
7、?信號放大:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min?。滴加相對應顏色Flare信號放大試劑，3-5min.將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min?。
8、?修復：組織切片置于盛滿(mǎn)EDTA修復液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內進(jìn)行抗原修復，中火8min?；?min中低火7min，此過(guò)程中應防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
9、?加試劑tunel工作液：按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑TdT酶和反應液試劑1:50混合，加到圈內覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃恒溫箱孵育1.5小時(shí)，濕盒內加少量水保持濕度。
10、DAPI復染細胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育
10min。
11、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
12、 鏡檢拍照：切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長(cháng)330-380nm，發(fā)射波長(cháng)420nm；
FITC綠光激發(fā)波長(cháng)465-495nm，發(fā)射波長(cháng)515-555 nm；CY3紅光激發(fā)波長(cháng)510-560，發(fā)射波長(cháng)590nm）